VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for MGI

Q1: RNA樣品質控

A1:為保證建庫質量，在實驗開始前必須對RNA樣品進行質控，RNA樣品總量、純度須滿足以下條件：

a).總RNA模板的起始投入量應≥ 50 ng ，若起始投入量過低，不能確保得到足夠的mRNA用于后

續文庫構建。

b).OD260/OD280比值應介于1.8 - 2.1之間，若比值＞ 2.1則RNA樣品中可能有基因組污染，若比值＜ 1.8則可能有蛋白質污染；OD230/OD260比值應介于0.4 - 0.5之間，若比值＞ 0.5則可能RNA樣品中有鹽或小分子雜質污染，比值＜ 0.4可能有基因組污染。

Q2: RNA樣品準備

A2:a).混勻含RNA樣品的溶液時應小心操作，輕柔吹打，切勿渦旋振蕩，否則會使RNA斷裂，影響

文庫片段大??；

b).經Poly(A)法富集的mRNA或去除rRNA后的RNA應盡快進行后續操作，避免RNA降解。

c).如果RNA的初始濃度較低時，可使用凍干、乙醇沉淀、過柱回收或VAHTS® RNA Clean Beads 

(Vazyme #N412)磁珠純化等方法濃縮RNA。

Q3: DNA純化磁珠的注意事項

A3:a). 磁珠從2 ~ 8℃取出后應平衡至室溫，否則影響磁珠的抓取效率。

b).每次吸取磁珠前都應將其渦旋振蕩充分混勻。

c).樣品與磁珠充分混勻后置于磁力架上進行分離時，待溶液徹底澄清后再吸取上清，吸取上清時應余留2 - 3 μl。若不慎吸到磁珠，會造成得率下降、分選效果不佳等問題，甚至影響后續酶反應，此時可將磁珠混勻重新置于磁力架上再次分離即可。由于磁力架吸力不同等原因，默認分離時間有時可能需要延長，以徹底分離磁珠和液體。

d).使用新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，久置的80%乙醇會導致雜質殘留以及文庫產出降低。漂洗過程中EP管應始終置于磁力架中，請勿擾動磁珠。

e).第二遍80%乙醇漂洗磁珠操作，應盡量吸干上清，減少雜質殘留。

f).產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥5 - 10 min足以讓磁珠充分干燥，請勿加熱干燥(如置于37℃烘箱干燥)。

Q4.其他注意事項

A4:a). 使用前請將試劑盒各組分置于冰上解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后

置于冰上待用。

b).建議使用帶濾芯的吸頭，在吸取不同樣品時更換吸頭。

c).在二鏈合成前使用的耗材必須為RNase-free，二鏈合成及之后為DNase-free。

d).實驗過程中務必使用新鮮的Nuclease-free H2O，建議分裝至小管中逐個取用，用后棄去。

e).務必佩戴手套操作，接觸RNase-free空間外設備或其他工作區間后，請更換手套。

f).所有的試劑使用后務必立即蓋上蓋子，避免污染。

g).推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

h).PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。因此，我們推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區域進行清潔，以保證實驗環境的潔凈度。

i).實驗過程中如需暫停，請嚴格按照使用方法中注明的可停放點將樣品放置于合適的溫度下保存，不正確存放可能會降低建庫成功率。