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VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI

科學研究試劑

高通量測序文庫構建試劑

藥物研發試劑

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    2020-06-30 23:14:06
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VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI

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NDM617-01/02
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產品詳情
FAQ
組分
說明書

VAHTS® Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI

兼容性廣:輕松應對不同物種來源、不同起始量投入量和不同模板類型

操作簡便:僅需根據目標插入片段大小調整片段化時間即可得到所需文庫

文庫產量高:卓越的文庫轉化率、樣本質量更好

VAHTS® Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI是針對MGI高通量測序平臺定向開發的DNA文庫構建試劑盒。本試劑盒將DNA片段化、末端修復以及末端加dA尾合并為一步,產物無需純化,直接進行接頭連接、文庫富集和分選,可將100 pg - 1 μg模板DNA轉換成MGI高通量測序平臺專用文庫,無需對基因組進行機械打斷,簡化了建庫流程、縮短了操作時間,適用于PCR文庫的構建。本試劑盒可完美兼容不同來源和不同投入量的DNA,僅需根據目標插入片段大小調整片段化時間即可得到所需文庫。試劑盒中提供的所有試劑都經過了嚴格的質量控制和功能驗證,最大程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

組分

NDM617-01 (24 rxn)

NDM617-02 (96 rxn)

FEA Buffer

120 μl

480 μl

FEA Enzyme Mix

240 μl

960 μl

Rapid Ligation Buffer 3

600 μl

4 × 600 μl

Rapid DNA Ligase

120 μl

480 μl

VAHTS HiFi Amplification Mix

600 μl

4 × 600 μl

PCR Primer Mix 3 for MGI

120 μl

480 μl

-30 ~ -15℃保存??捎?20 ~ 0℃運輸。

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:關于Input DNAFragmentation

A1:a).試劑盒兼容的Input DNA量范圍為50 pg - 1 μg。應盡可能使用A260/A280 = 1.8 - 2.0的高質量Input DNA。Table 1中列舉了常見應用中推薦的Input DNA量。

Table 1. 常見應用中推薦Input DNA

Input DNA Adapter:Input DNA
摩爾比
其他來源Adapter
工作濃度
Vazyme Adapter
預稀釋倍數
500 ng - 1 μg 10:1 - 20:1 510 μM 不稀釋
100 ng - 500 ng 20:1 - 100:1 10 μM 不稀釋
25 ng - 100 ng 50:1 - 200:1 5 μM 1:2
5 ng - 25 ng 40:1 - 200:1 1 μM 1:10
100 pg - 5 ng 60:1 - 3000:1 0.1-0.2 μM 1:30-1:200

上表為使用高質量DNA時推薦的Input DNA量,當Input DNA質量較差時,應適當上調使用量。

 

b).推薦使用滅菌超純水、0.1 × TE(low TE)或10 mM Tris-HCl(pH 8.0 - 8.5)溶解DNA樣品;FEA Enzyme mix對EDTA敏感,請確認DNA樣品中EDTA濃度,如打斷末修反應體系中EDTA終濃度大于0.1 mM,請按照08-1操作說明對DNA樣本進行預處理。

Q2:關于DNA Adapter

A2:a).針對MGI測序平臺,Vazyme提供一套共96種Indexed Adapters。

#NM108為單端10bp Indexed Adapters,共96種。

b).DNA Adapter的質量和用量直接影響建庫效率和文庫的質量。Adapter投入量過高可能會導致Adapter 或Adapter Dimer殘留;投入量不足又會影響連接效率進而導致文庫產出降低。Table 2列舉了不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

Table 2 100 pg - 1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

應用 樣本類型 推薦Input DNA量
全基因組測序 復雜基因組 50 ng - 1 μg
靶向捕獲測序 復雜基因組 10 ng - 1 μg
全基因組/靶向捕獲測序 FFPE DNA ≥ 50 ng
全基因組測序 微生物基因組 1 ng - 1 μg
全基因組測序(PCR-Free文庫) 復雜/簡單基因組 ≥ 50 ng (不進行長度分選)
≥ 200 ng (進行長度分選)
免疫共沉淀測序靶向測序 ChIP DNA ≥ 100 pg

uInput DNA摩爾數可根據下述公式粗略計算:

Input DNA摩爾數(pmol) ≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度(bp)]

u推薦根據表中的濃度值或Vazyme Adapter的稀釋倍數使用0.1 × TE預先稀釋Adapter,這樣可以保證建庫過程中Adapter的使用體積為固定數值(5 μl),避免加樣體積錯誤。

uAdapter的質量會直接影響AdapterInput DNA的摩爾比,進而影響連接效率和文庫產出。應選用優質的Adapter;使用0.1 × TE稀釋和保存Adapter溶液;盡量避免反復凍融。

u提高Adapter的使用量可以在一定程度上提高文庫產出,尤其當Input DNA ≤ 25 ng時。當需要優化建庫效率時,可在上表推薦條件下額外嘗試幾個更高的Adapter使用量(推薦2 - 10倍范圍內)。如Adapter液濃度限制無法提高使用量,可通過提高Adapter使用體積來嘗試。如:默認Adapter使用體積為5 μl,

uInput DNA500 ng - 1 μg時可提高Vazyme Adapter使用量至10 μl以增加5 - 15%的文庫產出。但是需注意提高接頭濃度可能會增加文庫中接頭殘留,造成測序數據浪費。

Q3:關于Adapter Ligation產物純化

A3:a).Adapter Ligation產物需先去除過剩的Adapter,再進行后續文庫擴增(PCR文庫)或直接上機測序(PCR-Free文庫)。默認純化條件0.6 × (產物100 μl,磁珠60 μl)適用于絕大多數情況。如需獲得Insert Size更長的文庫,可通過適當降低磁珠使用量以減少小片段文庫的含量,但這種調整只能粗略改變文庫主峰的位置,如需要準確控制文庫長度分布,可在此步純化之后進行長度分選。

b).如之后進行文庫長度分選,推薦洗脫體積為105 μl;否則,推薦洗脫體積為22.5 μl。

c).如數據顯示純化產物中Adapter或Adapter Dimer污染嚴重,可對其再進行一次磁珠純化:使用滅菌超純水將第一次純化產物體積補至50 μl,加入50 μl磁珠(1 ×)進行第二次純化。這樣可以顯著降Adapter或Adapter Dimer的殘留水平,尤其是當構建PCR-Free文庫時。有時可能還需要配合Adapter的使用量降低才能完全消除Adapter或Adapter Dimer的殘留

Q4:關于磁珠的使用

A4:a). 試劑盒推薦使用VAHTSTM DNA Clean Beads (Vazyme #N411)進行磁珠純化。

注意:如使用其他來源磁珠,純化條件可能需要更改!

b). 磁珠操作通用注意事項:

磁珠使用量常用乘數“ × ”進行標識,表示相對于原始樣品體積而言使用多少倍體積的磁珠。如樣品原始體積為100 μl ,1 ×純化時磁珠使用體積為1 × 100 μl = 100 μl;0.6 × / 0.2 ×分選時第一輪磁珠用量為0.6 × 100 μl = 60 μl第二輪磁珠用量0.2 × 100 μ= 20 μl。

磁珠使用量直接影響可純化的DNA長度下限。乘數越高,可純化的DNA長度下限越短;反之,則越長。例如:1 ×磁珠只能高效純化長于250 bp的DNA,更短的DNA會在純化過程中大量丟失;提高至1.8 ×后,150 bp的DNA也可進行高效純化。

磁珠使用前應先平衡至室溫(室溫放置30 min),否則會導致得率下降、分選效果不佳。磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

樣品與磁珠充分混勻后置于磁力架上進行分離時,請于溶液徹底澄清后再吸取上清,吸取上清時應余留2 - 3 μl。若不慎吸到磁珠,會造成得率下降、分選效果不佳甚至影響后續酶反應。此時可將磁珠混勻重新置于磁力架上再次分離即可。由于磁力架吸力不同等原因,默認分離時間有時可能需要延長,以徹底分離磁珠和液體。

磁珠漂洗應使用新鮮配制并平衡至室溫的80%乙醇。漂洗過程中EP管應始終置于磁力架中,請勿擾動磁珠。產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應;過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥5 - 10 min 足以讓磁珠充分干燥,請勿加熱干燥(如置于37 ℃烘箱干燥)。

通常情況下,推薦使用洗脫液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 - 8.5)進行產物洗脫,這樣更有利于產物的穩定保存。然而,當后續需對文庫進行靶向捕獲時,為了利于捕獲前文庫干燥濃縮且避免對后續捕獲反應產生影響,應使用滅菌超純水進行產物洗脫。

洗脫產物可于4℃穩定保存一周;長期保存時應置于-20℃,避免不必要的反復凍融。

Q5:關于長度分選

A5:a).如Input DNA分布范圍較寬,建庫過程中通常需要進行長度分選以控制最終文庫長度分布范圍。推薦使用雙輪磁珠分選方案,也可通過切膠純化的方式進行分選。

b).長度分選執行位置有多種選擇,可置于End Preparation之前、Adapter Ligation之后或Library Amplification之后。標準實驗方案中不包含長度分選步驟。如需進行,請參考附一、雙輪磁珠分選進行長度分選,DNA損失量較大。有時需要在文庫長度分布(進行長度分選)和文庫復雜度(不進行長度分選)之間進行選擇。當Input DNA量較低時,應保證長度分選執行位置的唯一性,進行兩次或者兩次以上的長度分選會導致文庫復雜度和產出嚴重下降!

c).過度擴增的文庫進行長度分布檢測時,常見高分子量位置出現拖帶或尾峰。對應產物多為非互補鏈交叉退火產物(參考06-6/關于Library Amplification)。推薦解決方案為調整擴增循環數,避免過度擴增,不建議通過長度分選去除拖帶或尾峰。

d).Rapid Ligation Buffer 3中包含的高濃度PEG會對雙輪磁珠分選和切膠純化產生顯著影響。因此,如在Adapter Ligation之后進行長度分選,Adapter Ligation產物純化步驟(08/標準方案/步驟二/6.使VAHTS DNA Clean Beads對反應產物進行純化)不可省略,將純化產物洗脫至合適體積的洗脫液中,再進行雙輪磁珠分選或切膠純化;如確需在Adapter Ligation之后分選,分選條件需另行摸索。如在Library Amplification之后進行長度分選,可將原處純化步驟直接替換為雙輪磁珠分選或切膠純化

Q6:關于Library Amplification

A6:a). PCR Primer Mix適用于擴增含完整長度Adapter的MGI高通量測序平臺文庫。推薦每條引物的擴增終濃度為5 - 20 μM。

b).PCR反應后期,引物通常會先于dNTP被耗盡。此時,過多的循環會造成擴增產物解鏈后進行非特異性退火,產生非互補鏈交叉退火產物。這些產物在依賴電泳的檢測方式中遷移速率比較慢,在高分子量區域呈現彌散分布。它們是由正確長度的單鏈文庫構成,在變性后能夠與Flow Cell正常結合并被測序。因此,其存在與否對測序而言并無顯著影響。然而,這種產物的存在對于文庫定量方式的選擇會產生決定性影響。因產物不是完整的雙鏈結構,當使用基于識別雙鏈DNA的熒光染料(Equalbit dsDNA HS Assay Kit, Vazyme #EQ111等)來進行文庫定量時,定量結果會比實際值偏低;但基于qPCR的文庫定量體系(如VAHTSTM Library Quantification Kit for MGI,Vazyme #NQM101 - NQ106)在定量過程中包含變性過程,仍然可以準確定量這種過度擴增的文庫。

c).Library Amplification步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足,會導致文庫產出不足;循環數過多,又會導致過度擴增、偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。Table 3列舉了當使用50 pg - 1 μg高質量Input DNA時,獲得100 ng或1 μg文庫推薦的擴增循環數。

Table 3. 50 pg - 1 μg Input DNA擴增循環數推薦表

Input DNA Number of cycles required to generate
100 ng
Number of cycles required to generate
1 μg

50 pg

100 pg

1 ng

10 ng

50 ng

100 ng

250 ng

500 ng

1 μg

15 - 17

14 - 16

10 - 12

5 - 7

3 - 5

1 - 3

0

0

0

17 - 19

15 - 17

12 - 14

8 - 10

5 - 7

4 - 6

3 - 5

3 - 4

1 - 3

上表為使用高質量的小鼠gDNA 37℃ 片段化8 min建庫測得的循環數參數。當DNA質量較差時,

需適當調整循環數以獲取足量文庫。

若連接接頭后進行長度分選,則參照較高循環數進行Library Amplification;否則,參照較低循環

數即可。

Q7:關于文庫的質量控制

通常情況下,構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

A7:a). 文庫長度分布檢測:

文庫長度分布可通過LabChip® GX、GXII、GX Touch (PerkinElmer);Bioanalyzer、Tapestation (Agilent Technologies);Fragment Analyzer™ (Advanced Analytical)等基于電泳分離原理的設備進行檢測。

常規適用于MGI平臺的Adapter均為“Ω”型Adapter,部分區域存在單鏈分叉區域。因此,Adapter Ligation之后未經擴增的PCR-Free文庫兩端都存在單鏈分叉區域。當進行文庫長度分布檢測時,這種單鏈的分叉結構會造成文庫遷移速率變慢,進而導致檢測結果偏長、分布范圍變寬、峰型異常等問題。為了準確檢測文庫長度分布,可取少量PCR-Free文庫進行適度PCR擴增,取擴增產物進行檢測以反映PCR-Free文庫的長度分布情況。也可通過檢測VAHTS®Library Quantification Kit for MGI (Vazyme #NQM101 - NQM106)擴增產物來反映PCR-Free文庫的長度分布情況

b). 文庫濃度檢測:

常用文庫濃度檢測方法有兩種:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Equalbit dsDNA HS Assay Kit (Vazyme #EQ111)、Equalbit® 1 × dsDNA HS Assay Kit(Vazyme #EQ121)、Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR絕對定量的方法,如VAHTS®Library Quantification Kit for MGI (Vazyme #NQM101 - NQM106)。雖然前者簡單易行,但由于下述原因,推薦使用基于qPCR絕對定量的方法進行文庫濃度測定。

當使用完整長度Adapter,且完成Adapter Ligation步驟之后,任何一個步驟產物都可以使用基于qPCR絕對定量的方法進行濃度測定??梢悦鞔_監控接頭連接、磁珠純化/分選、Library Amplification各步驟效率,進而能為體系優化和建庫異常原因分析提供依據.

因PCR-Free文庫缺少Library Amplification步驟,構建好的文庫中包含一定比例的單端連接Adapter的產物和兩端都未連接Adapter的產物。當使用Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時,無法有效區分這些產物。但qPCR絕對定量基于PCR擴增原理,只定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(即可測序文庫),可以排除單端或雙端都未連接Adapter的不可測序文庫的干擾。因此,PCR-Free文庫只能使用基于qPCR絕對定量的方法進行濃度測定。

過度擴增的文庫因包含大量不完整雙鏈結構,不能使用Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法。但基于qPCR絕對定量的方法不受過度擴增影響(參考06-6/關于Library Amplification)

Q8.其他注意事項

A8:a).DNA片段化產物的大小和分布范圍是由時間依賴的酶促反應決定的,因此配制片段化反應體系時應在冰上操作。

b).使用前請將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。為避免樣品交叉污染,推薦使用帶濾芯的槍頭,吸取不同樣品時請更換槍頭。

c).推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

d).PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染,進而影響實驗結果準確性。因此,我們推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離;使用專用的移液器等設備;并定時對各實驗區域進行清潔(使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理),以保證實驗環境的潔凈度。

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