3G Taq Master Mix for PAGE (Red Dye)

Q1：擴增效率低，實驗組無擴增條帶。

A1：(1) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解；引物設計是否合理，可利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

(2) 模板

長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解，應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板；模板GC含量過高會導致DNA的雙鏈無法打開，此時加入PCR Enhancer（貨號P021），可以有效降低解鏈溫度；模板的GC含量過低會導致擴增效率較差，可適當延長引物長度或通過梯度PCR摸索合適的反應條件；模板中存在抑制物，特別是甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，會造成DNA脫嘌呤而影響PCR結果，建議稀釋使用或重新制備；若模板為cDNA，要確認逆轉錄所用RNA的純度及完整度。

(3) 擴增體系

反應體系配制錯誤，建議重復實驗。

(4) 反應程序

檢查變性溫度是否準確，PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符。如果溫度過高，酶在前幾個循環就迅速失活；溫度過低則模板變性不徹底?？蓪ν嘶饻囟仍O置梯度，摸索最佳的退火溫度。檢測延伸時間是否充足。

(5) Mg2+濃度不合適

Mg2+濃度過低可影響PCR產量甚至使PCR擴增失??；Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性，應適當調整Mg2+濃度。

Q2：擴增的條帶亮度不太亮。

A2：(1) 引物

檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解。

(2) 模板

首先確認模板的質量，長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解，應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板；如果模板沒有了，可用首次擴增產物按倍比稀釋后作為模板進行二次擴增。

 (3) 反應程序

可嘗試使用Touch Down程序；延長延伸時間，提高循環數。

Q3：擴增特異性差，非特異性擴增。

A3：(1) 引物

引物設計不夠優化。引物與靶序列有非特異性互補或自身聚合成二聚體，可降低引物濃度進行優化，必要時重新設計引物。

(2) 模板

模板不純，被污染，需重新制備模板。

模板降解或過量，通過電泳檢查模板完整性及濃度，必要時重新純化模板。模板的使用量請參考說明書。

(3) 反應程序

反應程序不夠優化。如果出現比目的條帶小的雜帶，可通過提高退火溫度，降低循環數調整；如果出現比目的條帶大的雜帶，可縮短延伸時間、降低循環數。

Q4：空白對照出現擴增產物。

A4：(1) 引物設計不合理

擴增序列與非目的擴增序列有同源性，PCR也可以擴增出非靶序列的序列。

(2) 若擴增產物條帶大小與目的條帶一致，說明有污染

更換新的Mix、水或引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。

(3) 為了避免靶序列受到整個基因組或大片段的交叉污染，操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。

(4) 為了避免靶基因受到空氣中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法減輕或消除污染。