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    2020-06-30 00:05:30
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Discover-sc WTA Kit V2

Discover-scWTAKitV2單細胞轉錄組測序文庫構建最佳搭檔模板起始量低:單個細胞或10pgTotalRNA即可作為起始模板,進行高效擴增擴增靈敏度高:使用LNA技術及精心優化的反應體系,大幅度增加了低表達基因的檢出量產物完整性好:通過雙端引物擴增全長cDNA,獲得全轉錄組信息,避免了5'和3'偏好性操作成功率大:大大減少了RNA樣品的處理,從而最大限度避免了樣品損失的風險,提高了操作成
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說明書

Discover-sc® WTA Kit V2

單細胞轉錄組測序文庫構建最佳搭檔

模板起始量低:單個細胞或10pg Total RNA即可作為起始模板,進行高效擴增

擴增靈敏度使用LNA技術及精心優化的反應體系,大幅度增加了低表達基因的檢出量

產物完整性好:通過雙端引物擴增全長cDNA,獲得全轉錄組信息,避免了5'和3'偏好性

操作成功率大:大大減少了RNA樣品的處理,從而最大限度避免了樣品損失的風險,提高了操作成功率

體積兼容性廣:樣品兼容體積可高達5 μl,兼容不同濃度的模板進行擴增 

1.模板起始量低,擴增產物cDNA完整性好

10 pg 293T細胞Total RNA用Discover-sc® WTA Kit V2進行擴增,取1 μl cDNA擴增產物用Agilent 2100 Bioanalyzer進行分析。試劑盒以Oligo dT Primer為逆轉錄引物,并利用Discover-sc® Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接頭序列,通過該接頭序列進行后續的PCR擴增,獲得全長cDNA擴增產物,同時避免了rRNA的污染。

 

2.文庫質量分析—數據基本指標

Vazyme-1和Vazyme-2是單個293T細胞經過Discover-sc® WTA Kit V2 進行擴增,C-1和C-2是單個293T細胞經過用C公司單細胞轉錄組試劑盒進行擴增,取1 ng cDNA擴增產物經TruePrep® DNA Library Prep Kit V2 for Illumina構建文庫。以下均為此文庫數據分析。

 

3.基因表達總體情況分析

Discover-sc® WTA Kit V2試劑盒擴增產物檢測靈敏度高,單個293T細胞檢測到基因數高達15000個。

 

4.數據分布均一,無偏好性

左圖為Vazyme-1測序片段在基因上的分布結果,右圖為C-1測序片段在基因上的分布結果,數據顯示Discover-sc® WTA Kit V2擴增很好的保證了基因5’和3’的覆蓋。

 

5.表達重復相關性高

左圖為Vazyme-1和Vazyme-2表達重復相關性分析,右圖為C-1和C-2表達重復性相關性分析。數據結果表明表達重復相關性高于C公司。

 Discover-sc® WTA Kit V2能以1-1000個細胞或10 pg-10 ng總RNA為模板,通過第一鏈cDNA合成及擴增,獲取足夠的用于序列分析的樣本,從而解決了諸如單細胞等微量樣本因RNA含量過低導致的無法使用常規mRNA-seq進行測序分析的技術難題。試劑盒以Oligo dT Primer為逆轉錄引物進行cDNA合成,并利用Discover-sc® Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接頭序列,通過該接頭序列進行后續的PCR擴增,獲得全長cDNA擴增產物,有效避免了cDNA合成過程中的3’偏好性和rRNA的污染。

      Discover-sc® WTA Kit V2是在Discover-sc® WTA Kit基礎上開發的升級版本,其檢測靈敏度、體積兼容性均得到了大幅度提升,更加適合低豐度基因及低濃度模板的檢測。

Box 1,-70°C儲存; Box 2,-20°C儲存。

關鍵詞:
Discover-sc WTA Kit V2
單細胞轉錄組測序文庫構建最佳搭檔
n712
未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:單細胞轉錄組擴增時,在獲得單細胞后不立即進行擴增,細胞該如何保存?

A1:可以將細胞放入裂解液后于-70℃保存一段時間,但是不建議存放時間過長。

Q2:單細胞轉錄組擴增出現小片段,可能原因有哪些?

A2:(1)樣本出現降解,即取樣前細胞已死亡,可嘗試重新準備樣品;

(2)樣本中引入抑制組分,如:胰酶、臺盼藍、高濃度的EDTA、巰基乙醇等??蓢L試將細胞在PBS中多清洗重懸幾次以解除抑制,或參照3情況解決;

(3)內源性RNA酶過多,在細胞裂解過程中將RNA降解,常見于免疫細胞或一些特殊的組織中??稍诩尤爰毎麡颖厩?,在裂解液中加入1%巰基乙醇,用RNA磁珠純化后再繼續進行后續實驗。

Q3:RNA樣本能否使用N711進行擴增?

A3:RNA進行擴增前,要進行質檢。這是因為N711試劑盒只針對帶有3’poly(A)的轉錄本進行擴增。如果RNA質量完整度不好,會丟失5’轉錄本的信息。如果RNA質量較好,可以使用N711。

Q4:單細胞轉錄組擴增后,cDNA兩端的擴增引物會占用測序讀長,怎樣去除?

A4:可將單細胞轉錄組擴增與轉座酶建庫搭配使用。這是因為單細胞轉錄組擴增后會在cDNA 的3’和5’端分別引入錨定序列,而轉座酶建庫會丟失一部分cDNA的3’和5’端序列,這樣就能實現cDNA兩端的擴增引物的去除,提高測序覆蓋度。

Q5:單細胞轉錄組擴增后,產物濃度過低,怎樣改善?

A5:不同的細胞樣本其RNA含量不同,可通過增加擴增循環數來改善。比如免疫細胞,其RNA含量一般比較少,可根據已測試的結果進行循環數的調整。

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VAHTS DNA Clean Beads
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