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高通量測序文庫構建試劑

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    2020-06-30 00:08:57
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VAHTS mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina

常規轉錄組建庫VAHTSTM?mRNA-seqv2LibraryPrepKitforIllumina?圖1.選擇1μg或100ng人胚腎上皮細胞HEK293總RNA、水稻幼苗總RNA、桃果實總RNA,用VAHTSTM?mRNA-seqv2LibraryPrepKitforIllumina?分別構建插入片段大小為200-300bp或150-200bp的轉錄組文庫。文庫用Agilent2100Bioa
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產品詳情
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說明書

VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina

常規轉錄組建庫

對于復雜植物模板具有很高的成功率

建庫流程與Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2相同

優化的大片段建庫方案

測序數據與Illumina試劑具有高度的一致性

圖1. 選擇1 μg 或100 ng人胚腎上皮細胞HEK293總RNA、水稻幼苗總RNA、桃果實總RNA,用VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina分別構建插入片段大小為200-300 bp或150-200 bp的轉錄組文庫。文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer進行分析。

表1. 1 μg 或100 ng universal human reference RNA分別用VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2構建文庫。文庫用Qubit定量后,按照相同濃度混樣,用Hiseq 2500測序??梢钥吹?,用Vazyme試劑盒構建的文庫具有和Illumina非常近似的數據產出和數據質量。

圖2. 1 μg (A)或100 ng (B) universal human reference RNA分別用VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2構建文庫,用Hiseq 2500測序,分析數據均一性分布??梢钥闯?,本產品構建的文庫數據分布均勻,沒有5’或3’偏好性,并且和Illumina試劑盒高度一致。

圖3. 1 μg 或100 ng universal human reference RNA分別用VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina以及Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2構建文庫,用Hiseq 2500測序,兩兩比較表達重復相關性,以spearman相關系數r表示??梢钥闯?,1 μg (A)、100 ng (B)模板量下Vazyme VAHTS?和Illumina TruSeq之間,以及用Vazyme VAHTS?建庫1 μg和100 ng之間 (C)的相關系數r均大于0.97,說明具有很高的表達重復相關性。

 VAHTS? mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina適用于起始模板為0.1-1 μg總RNA的Illumina平臺轉錄組文庫構建。本產品的模板適應性廣泛, 對于植物樣本具有很高的建庫成功率。本產品不僅提供與Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2相同的建庫流程 (插入片段150-200 bp),還針對插入片段大于200 bp的文庫提供優化的打斷及分選條件。用本產品構建的文庫在數據產出及數據質量上均與Illumina官方試劑盒保持高度的一致性。

  組分 NR601-01(24 rxn) NR601-02(96 rxn)
NR 1 mRNA Capture Beads 1.2 ml 4.8 ml
Beads Binding Buffer 1.2 ml 4.8 ml
Beads Wash Buffer 9.6 ml 38.4 ml
Tris Buffer 1.2 ml 4.8 ml
NR 2 Frag/Prime Buffer 468 μl 2 × 936 μl
1st Strand Buffer 144 μl 576 μl
1st Strand Enzyme Mix 48 μl 192 μl
2nd Strand Buffer 480 μl 2 × 960 μl
2nd Strand Enzyme Mix 120 μl 480 μl
NR 3 End Prep Mix 960 μl 4 × 960 μl
dA-Tailing Buffer Mix 240 μl 960 μl
dA-Tailing Enzyme Mix 60 μl 240 μl
Ligation Mix 60 μl 240 μl
Stop Ligation Mix 120 μl 480 μl
PCR Primer Mix 120 μl 480 μl
Amplification Mix 1 600 μl 4 × 600 μl

Box 1: 2-8°C保存。

Box 2 :-20°C保存。

Box 3 :-20°C保存。

適用范圍

起始模板:0.1–1 μg完整度良好的總RNA。建議用Agilent 2100 Bioanalyzer對提取的總RNA進行質控,RIN值應≥8。不完整或降解的總RNA模板會給測序結果帶來3’偏好性。

轉錄本信息:本試劑盒適合于針對mRNA的RNA-seq分析,包括:基因表達、單核苷酸變異 (single nucleotide variation),可變剪切/融合基因、目標轉錄組分析等。如果需要分析非編碼RNA,請選擇VAHTSTotal RNA-seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #NR603)。

關鍵詞:
VAHTS mRNA-seq v2 Library Prep Kit for Illumina?
NR601-01/02
未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

Q1:FFPE樣本是否可以用該試劑盒建庫?

A1:FFPE樣本中的mRNA會有一定降解,完整度較差,建議使用VAHTS? Total RNA-seA (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina?( Vazyme #NR603)試劑盒進行文庫構建。

Q2:收到試劑盒后,誤將NR1放置 -20 ℃保存,是否還可以繼續使用?

A2:低溫會破壞磁珠,不可再繼續使用??闪硇胁少弻KVAHTS? mRNA Capture Beads(Vazyme #N401)。

Q3:關于在進行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit 及qPCR檢測時,高產量文庫出現過度擴增的解釋。

A3:高產量文庫通常會出現不同程度的過度擴增現象。因為在文庫擴增后期,通常引物被最先耗盡,大量文庫片段在無法結合到引物的情況下,片段之間通過不完全匹配關系退火結合,從而形成部分雙鏈+部分單鏈的雜合鏈,且片段更大。根據不同檢測方式的對應原理,過度擴增產物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表現為upper marker之后有輕微翹尾;在Qubit 測定時,單鏈部分不計入有效濃度,但在APCR過程單鏈能夠被有效測定,因此表現為Qubit 測定濃度低于qPCR定量濃度約10%-50%,但以上現象均屬正常,不影響文庫測序和數據分析。

Q4:本試劑盒是否適合用于small RNA文庫制備?

A4:不適用。因為small RNA的長度僅為22 nt左右,而本試劑盒中磁珠抓取片段最低為100bp以上,無法有效富集到small RNA片段。

Q5:文庫進行Agilent 2100 Bioanalyzer質檢,發現產生雙峰,產生的原因?

A5:(1)RNA有雜質殘留,建庫過程中發生降解,到PCR步驟前的有效模板量低,PCR時由于模板不足發生了非特異性擴增。建議將RNA樣品在65℃條件下加熱15 min,檢測是否降解,如果確實為RNA的問題則需要重新提取RNA。

(2)物種本身比較特殊,RNA打斷后片段不是連續且均一的分布,做分選方案時可能分選到了兩個范圍的片段。

(3)特殊物種的mRNA豐度較低,PCR的有效模板較低。建議加大投入量或者做重復樣品到二鏈合成后的純化步驟合并在一起。

 

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VAHTS DNA Clean Beads
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